清華新聞網(wǎng)9月30日電 CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物的獲得性免疫系統(tǒng)，能夠在CRISPR RNA的指導(dǎo)下特異性切割入侵的外源核酸。其中，分別以Cas9和Cas12為效應(yīng)蛋白的type II類(lèi)和V類(lèi)CRISPR系統(tǒng)已成為當(dāng)前基因組編輯的重要工具，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。已有研究表明，Cas12起源于IS200/605和IS607轉(zhuǎn)座子家族編碼的TnpB核酸酶。TnpB蛋白廣泛存在于細(xì)菌和古菌的轉(zhuǎn)座子中，是原核生物中最龐大、最豐富的轉(zhuǎn)座子相關(guān)核酸酶家族之一。TnpB和Cas12在種類(lèi)和結(jié)構(gòu)上具有高度多樣性，從TnpB到Cas12的進(jìn)化被認(rèn)為是“多次獨(dú)立起源”的轉(zhuǎn)座子-免疫系統(tǒng)復(fù)雜進(jìn)化事件。闡明CRISPR系統(tǒng)從轉(zhuǎn)座子起源的分子機(jī)制，是該領(lǐng)域長(zhǎng)期懸而未解的科學(xué)難題。
9月29日，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞團(tuán)隊(duì)、清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰團(tuán)隊(duì)、中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所張勇團(tuán)隊(duì)合作在《細(xì)胞》（Cell）期刊發(fā)表題為“功能性RNA分裂驅(qū)動(dòng)V型CRISPR系統(tǒng)從轉(zhuǎn)座子的演化產(chǎn)生”（Functional RNA splitting drove the evolutionary emergence oftype V CRISPR-Cas systems from transposons）的研究論文。研究團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)七年深入探索，首次發(fā)現(xiàn)并定義了連接轉(zhuǎn)座子與CRISPR之間長(zhǎng)期缺失的關(guān)鍵進(jìn)化中間體，命名為T(mén)ranC（Transposon-CRISPR intermediate），彌合了CRISPR進(jìn)化歷程中的缺口。研究揭示，驅(qū)動(dòng)TnpB轉(zhuǎn)座酶向Cas12系統(tǒng)演化的核心機(jī)制源于引導(dǎo)RNA的“功能性分裂”，而非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的根本性改變。這一發(fā)現(xiàn)不僅破解了Cas12起源的分子機(jī)制之謎，也首次以實(shí)驗(yàn)證據(jù)闡明了RNA層面的創(chuàng)新如何驅(qū)動(dòng)復(fù)雜分子機(jī)器的進(jìn)化進(jìn)程。
TranC系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)揭示了CRISPR起源的關(guān)鍵分子機(jī)制
研究團(tuán)隊(duì)首先結(jié)合序列相似性、共享結(jié)構(gòu)域特征和保守催化基序三重搜索方法，從原核生物基因組與宏基因組數(shù)據(jù)中，鑒定出146個(gè)與TnpB親緣關(guān)系較近的CRISPR偶聯(lián)候選蛋白。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析、AlphaFold結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與功能元件對(duì)比，最終從中鑒定出6個(gè)演化中間家族，命名為T(mén)ranC。這些TranC系統(tǒng)均與特定的TnpB分支構(gòu)成姊妹群體，代表了TnpB向Cas12演化過(guò)程中的多個(gè)獨(dú)立起源路徑。其中，除此前已報(bào)道的Clade 8（Cas12n，源自IS607家族）外，研究新鑒定的Clade3、11、12、13、14源自IS605轉(zhuǎn)座子家族，進(jìn)一步描繪了Cas12系統(tǒng)多次“獨(dú)立演化”的復(fù)雜場(chǎng)景。
功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TranC系統(tǒng)具有獨(dú)特的“雙RNA導(dǎo)向機(jī)制”。在大腸桿菌體系中，來(lái)自多個(gè)支系的5個(gè)代表性TranC系統(tǒng)不僅能夠使用自身編碼的CRISPR RNA（tracrRNA+crRNA）進(jìn)行靶向切割，還保留了祖先TnpB使用reRNA（transposon-derived right-end RNA，亦稱(chēng)ωRNA）作為向?qū)У哪芰Α＿M(jìn)一步在人類(lèi)細(xì)胞體系開(kāi)展的基因組編輯實(shí)驗(yàn)顯示，來(lái)自Clade3、源于人類(lèi)腸道細(xì)菌Lawsonibacter sp.的LaTranC系統(tǒng)，能夠同時(shí)使用CRISPR RNA與ISDra2 TnpB的reRNA開(kāi)展基因組編輯。這種兼具兩種RNA識(shí)別能力的“雙重導(dǎo)向”機(jī)制，是TranC系統(tǒng)作為T(mén)npB向Cas12演化中間體的重要功能標(biāo)志，也為理解CRISPR系統(tǒng)的起源提供了關(guān)鍵證據(jù)。
進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析揭示，TranC蛋白與其祖先TnpB蛋白在三維結(jié)構(gòu)上高度保守，其差異主要體現(xiàn)在RNA層面。冷凍電鏡解析表明，LaTranC與CRISPR RNA（tracrRNA + crRNA）形成的復(fù)合體，與其姊妹分支ISDra2 TnpB與reRNA形成的復(fù)合體在結(jié)構(gòu)上高度一致。結(jié)構(gòu)對(duì)比首次觀(guān)測(cè)到，TnpB系統(tǒng)中由單一reRNA構(gòu)成的向?qū)NA，在TranC中演化為功能分離的tracrRNA與crRNA兩個(gè)模塊，從而建立起典型的CRISPR雙RNA導(dǎo)向結(jié)構(gòu)。這一“RNA功能性分裂”的現(xiàn)象不僅在LaTranC中被驗(yàn)證，也通過(guò)AlphaFold結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和RNA共變異分析在其他TranC支系中被普遍觀(guān)察，提示其為Cas12系統(tǒng)多次獨(dú)立起源過(guò)程中的趨同進(jìn)化特征。
為進(jìn)一步驗(yàn)證RNA分裂在CRISPR系統(tǒng)起源中的關(guān)鍵作用，研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)?zāi)M了從TnpB到TranC的演化路徑。結(jié)果表明，僅通過(guò)將ISDra2 TnpB的reRNA模塊功能性拆分為嵌合型tracrRNA與LaTranC來(lái)源的crRNA兩部分，即可賦予其利用CRISPR陣列進(jìn)行靶向識(shí)別與基因組切割的能力。換言之，該系統(tǒng)已從單RNA導(dǎo)向的TnpB機(jī)制轉(zhuǎn)變?yōu)殡pRNA導(dǎo)向的類(lèi)CRISPR機(jī)制。綜上，研究通過(guò)多學(xué)科方法，首次明確指出，RNA層面的功能性分裂與模塊化創(chuàng)新，而非蛋白結(jié)構(gòu)的根本性改變，是驅(qū)動(dòng)CRISPR-Cas系統(tǒng)由轉(zhuǎn)座子演變?yōu)槊庖呦到y(tǒng)的核心分子機(jī)制。
高彩霞研究員、劉俊杰副教授、張勇研究員為論文的共同通訊作者；中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所已出站博士后靳帥、2018級(jí)博士生朱子旭（已畢業(yè)）、2021級(jí)博士生李運(yùn)嘉和清華大學(xué)已出站博士后張壽悅為論文共同第一作者。研究得到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院穩(wěn)定支持基礎(chǔ)研究領(lǐng)域青年團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目和新基石科學(xué)基金項(xiàng)目的資助。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.09.004
供稿：生命學(xué)院
編輯：李華山
審核：郭玲
