清華新聞網(wǎng)2月13日電 中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）是致病性最強(qiáng)的人類(lèi)冠狀病毒，該病毒可從自然感染的野生單峰駝向人類(lèi)傳播，構(gòu)成持續(xù)的感染和致病風(fēng)險(xiǎn)。2012年首次在沙特阿拉伯發(fā)現(xiàn)，該病毒已導(dǎo)致全球約2600多例病例和900多例死亡。其中絕大多數(shù)的感染和死亡病例由沙特阿拉伯王國(guó)報(bào)告。阿拉伯半島和非洲的野生單峰駝作為MERS-CoV的主要自然宿主和傳染源，從幼齡到成年呈現(xiàn)MERS-CoV抗體逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，有的地區(qū)抗體陽(yáng)性率高達(dá)90%以上，對(duì)單峰駝的免疫保護(hù)發(fā)揮著重要作用。然而，這些抗體的效價(jià)、特異性、結(jié)構(gòu)特征和保護(hù)機(jī)制不詳。目前也尚無(wú)獲批的MERS-CoV特異性抗病毒治療藥物和疫苗。研究自然感染單峰駝的抗體應(yīng)答，尤其研究其產(chǎn)生獨(dú)特的遺傳、結(jié)構(gòu)和功能特征的納米抗體，能為研發(fā)MERS-CoV有效防治手段提供優(yōu)質(zhì)的候選分子，也為研發(fā)高效疫苗提供指導(dǎo)和參考。
2月9日，清華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院張林琦教授團(tuán)隊(duì)、生命學(xué)院王新泉教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合突尼斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Balkiss Bouhaouala-Zahar教授團(tuán)隊(duì)，在《美國(guó)科學(xué)院院刊》（PNAS）期刊在線(xiàn)發(fā)表了題為“解碼野生駱駝MERS-CoV自然感染的抗體反應(yīng)”（Decoding antibody response to MERS-CoV in wild dromedary camels）的研究論文。該研究首次對(duì)野生單峰駝的MERS-CoV抗體應(yīng)答進(jìn)行了全面深入研究，篩選出一系列具有高效中和活性的納米抗體。這些納米抗體可識(shí)別病毒刺突蛋白受體結(jié)合域（RBD）上尚未被報(bào)道的結(jié)合與中和位點(diǎn)，遺傳與結(jié)構(gòu)功能特征獨(dú)特，不僅為解析單峰駝的抗MERS-CoV免疫機(jī)制提供了新視角，也為MERS-CoV預(yù)防和治療藥物的研發(fā)篩選出極具潛力的候選分子。
研究團(tuán)隊(duì)采集9頭野生單峰駝的血液樣本，檢測(cè)血漿抗體對(duì)MERS-CoV、SARS-CoV-1、SARS-CoV-2刺突蛋白三聚體及RBD的結(jié)合活性，從中和活性最高的單峰駝D17中，通過(guò)VHH噬菌體文庫(kù)構(gòu)建與篩選得到34條獨(dú)特的納米抗體VHH序列。通過(guò)陽(yáng)性納米抗體VHH的遺傳特征分析發(fā)現(xiàn)，這些序列具有全新的遺傳特征：含異常長(zhǎng)的CDR3區(qū)（75.7%的序列CDR3≥22個(gè)氨基酸），顯著長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)免疫駝源納米抗體；約26%的序列使用此前未報(bào)道的IGHV種系基因，遺傳多樣性更高，且多數(shù)序列含額外的半胱氨酸殘基，可形成第二對(duì)二硫鍵增強(qiáng)納米抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
圖1. VHH-227和VHH-T71與MERS-CoVRBD復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析
研究團(tuán)隊(duì)選取8株不同系統(tǒng)發(fā)育簇的代表納米抗體構(gòu)建VHH-hFc融合蛋白深入研究，測(cè)試其對(duì)MERS-CoV RBD具有高親和力結(jié)合和高效中和活性，解離常數(shù)（KD）低至7.71×10?12M，假病毒中和IC50為1.05~9.55 ng/mL，且與SARS-CoV-1和SARS-CoV-2無(wú)交叉反應(yīng)，靶向特異性強(qiáng)。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)而對(duì)代表性的納米抗體VHH-227和VHH-T71開(kāi)展結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，解析其與MERS-CoV RBD形成的二元/三元復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，明確二者在RBD上的結(jié)合位點(diǎn)、與RBD的相互作用殘基及結(jié)合模式，展示出兩種截然不同的納米抗體中和機(jī)制：VHH-227結(jié)合于RBD的DPP4結(jié)合位點(diǎn)，與DPP4的結(jié)合區(qū)域高度重疊，通過(guò)完全阻斷病毒受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)100%中和；VHH-T71結(jié)合于RBD的核心亞結(jié)構(gòu)域，為首次報(bào)道的MERS-CoV第4組表位的抗體，不與DPP4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，而是通過(guò)誘導(dǎo)刺突蛋白S1亞基部分脫落、刺突三聚體聚集的機(jī)制實(shí)現(xiàn)約80%的中和。VHH-227和VHH-T71靶向的表位在MERS-CoV流行株中高度保守，二者對(duì)已發(fā)現(xiàn)的MERS-CoV天然RBD突變株及突變組合均保持完全的中和活性，具備應(yīng)對(duì)病毒突變的廣譜性。
圖2.納米抗體VHH-227-hFc和VHH-T71-hFc的中和機(jī)制研究
本研究發(fā)現(xiàn)的新型納米抗體為MERS-CoV防治藥物研發(fā)提供了極具潛力的候選分子，同時(shí)也為解析單峰駝抗MERS-CoV的天然抗體免疫水平、遺傳和功能特點(diǎn)、理解冠狀病毒的跨物種傳播和抗體保護(hù)機(jī)制提供了重要的依據(jù)和參考。
張林琦、王新泉、Balkiss Bouhaouala-Zahar課題組為本論文的共同通訊作者。清華大學(xué)與突尼斯大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)學(xué)生FatenIdoudi、清華大學(xué)出站博士后王若珂、清華大學(xué)博士田龍為該論文共同第一作者。本研究得到了中國(guó)國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、新發(fā)突發(fā)與重大傳染病防控國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金、清華大學(xué)專(zhuān)項(xiàng)基金、巴斯德研究所網(wǎng)絡(luò)以及突尼斯高等教育與科學(xué)研究部等的資助。
論文鏈接：
https://doi.org/10.1073/pnas.2513716123
供稿：生命學(xué)院
編輯：邱收
審核：周襄楠
